Colorarea Gram este o tehnică rapidă și este utilizată pentru a vedea prezența bacteriilor într-o probă de țesut și pentru a clasifica bacteriile ca Gram-pozitive sau Gram-negative, pe baza proprietăților chimice și fizice ale pereților lor celulari. Pata Gram este aproape întotdeauna utilizată ca primul pas în diagnosticarea unei infecții bacteriene.
Această tehnică de colorare poartă numele omului de știință danez Hans Christian Gram (1853 - 1938), care a dezvoltat tehnica în 1882 și a publicat-o în 1884 ca o tehnică pentru a distinge două tipuri de bacterii cu simptome clinice similare: Streptococcus pneumoniae (cunoscut și ca Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) și a bacteriei Klebsiella pneumoniae.
Etapa
Metoda 1 din 3: Pregătirea diapozitivului pentru microscop
Pasul 1. Pregătiți-vă să lucrați în laborator
Purtați mănuși și o cravată lungă pentru a preveni contaminarea bacteriană a probei pe care o testați. Curățați spațiul de lucru sub o hotă de fum sau într-o altă zonă bine ventilată. Verificați arzătorul Bunsen și asigurați-vă că microscopul funcționează corect înainte de a începe.
Pasul 2. Sterilizați lamela de sticlă a microscopului
Dacă lamela de sticlă este murdară, spălați-o cu apă cu săpun pentru a îndepărta uleiul și murdăria. Curățați lamelele cu etanol, produs de curățat geamuri sau o altă metodă utilizată de laboratorul dumneavoastră.
Pasul 3. Așezați proba pe lamela de sticlă
Puteți utiliza tehnica de colorare Gram pentru a ajuta la identificarea bacteriilor dintr-o probă medicală sau a unei culturi de bacterii care cresc într-o cutie Petri. Pentru cele mai bune rezultate, utilizați colorarea Gram pe cursuri subțiri ale probei. Este recomandabil să utilizați probe care au o vechime mai mică de 24 de ore, deoarece bacteriile mai vechi ar putea să-și fi deteriorat pereții celulari și să nu răspundă la colorarea Gram.
- Dacă utilizați o probă de țesut, adăugați 1-2 picături la o lamă de sticlă. Răspândiți uniform pe lamelă pentru a forma un strat subțire de stropire a probei, glisând-o folosind marginea celeilalte lamele de sticlă sterile. Lăsați-l să se usuce înainte de a face pasul următor.
- Dacă luați bacterii dintr-o cutie Petri, sterilizați bucla de inoculare într-un arzător Bunsen până când luminează, apoi lăsați-o să se răcească. Utilizați bucla pentru a picura apă sterilă pe lamă, apoi sterilizați și răcoriți din nou înainte de a o utiliza pentru a colecta o mică probă de bacterii. După aceea amestecați ușor.
- Bacteriile preparate în bulion trebuie agitate din nou folosind un vortex, apoi luate cu bucla de inoculare ca mai sus, fără a adăuga apă.
- Dacă aveți o probă de tampon (de obicei făcută cu un mâner mic cu vârf de bumbac), atingeți și rotiți ușor tamponul peste lamelă.
Pasul 4. O temperatură ușor ridicată poate face un frotiu bun
Căldura va ține bacteriile deasupra diapozitivului, astfel încât să nu se dizolve ușor în timpul procesului de colorare. Atingeți diapozitivul rapid de două până la trei ori peste un arzător Bunsen sau încălziți diapozitivul peste un încălzitor electric. Nu supraîncălziți, proba poate fi deteriorată. Dacă utilizați un arzător Bunsen, acesta ar trebui să fie o flacără mică, dar albastră, în loc de o flacără mare portocalie.
Alternativ, se poate face un frotiu cu metanol, prin adăugarea a 1-2 picături de metanol la un frotiu uscat, uscând metanolul rămas pe lamă lăsându-l în aer liber. Această tehnică minimizează deteriorarea celulei și oferă un fundal curat al imaginii diapozitive
Pasul 5. Poziționați diapozitivul peste tava de colorat
Tăvile de colorare sunt realizate din metal, sticlă sau plăci de plastic de mică adâncime, cu o plasă moale căptușind partea superioară. Așezați lamele deasupra acestor plase, astfel încât lichidul pe care îl folosiți să poată fi scurs în tavă.
Dacă nu aveți o tavă de colorat, puteți așeza un diapozitiv pe o tavă de plastic pentru a imprima cuburi de gheață
Metoda 2 din 3: Procesul de colorare a Gramului
Pasul 1. Se toarnă lichidul cristal violet peste frotiu
Folosiți o pipetă pentru a pulveriza o probă de bacterii cu câteva picături de colorant violet cristal, cunoscut și sub numele de violetă gentiană. Se lasă 30-60 de secunde. Violetul de cristal (KV) se separă în soluție apoasă în ioni KV + și clorură (Cl-). Acești ioni penetrează pereții celulari și membranele celulare ale bacteriilor gram-pozitive și gram-negative. Ionul KV + interacționează cu componentele încărcate negativ ale celulelor bacteriene, conferind celulelor o culoare violet.
Multe laboratoare folosesc cristalul "Hucker" violet, care conține oxalat de amoniu pentru a preveni precipitațiile
Pasul 2. Clătiți ușor cristalul violet
Înclinați diapozitivul și folosiți o sticlă de spălat pentru a pulveriza un flux mic de apă distilată sau de la robinet peste diapozitiv. Apa trebuie să curgă peste suprafața frotiului și nu trebuie pulverizată direct pe frotiu. Nu clătiți excesiv. Poate elimina colorarea bacteriilor Gram pozitive.
Pasul 3. Spălați frotiul cu iod, apoi clătiți
Folosiți un picurător pentru a spăla frotiul cu iod. Lăsați-l să acționeze cel puțin 60 de secunde, apoi clătiți cu atenție în același mod ca mai sus. Iodul, sub forma unui ion încărcat negativ, interacționează cu KV + pentru a forma un complex compus mare între violetul de cristal și iodul (complexul compus CV-I) în straturile interioare și exterioare ale celulei. Acest complex de compuși va păstra culoarea violet a cristalului violet în interiorul celulei, în locațiile colorate.
Iodul este o substanță corozivă. Evitați inhalarea, ingestia sau contactul cu pielea
Pasul 4. Adăugați înălbitor de culoare, apoi clătiți rapid
Un amestec 1: 1 de acetonă și etanol este de obicei utilizat pentru această etapă importantă, care trebuie temporizată cu atenție. Poziționați diapozitivul la un anumit unghi, apoi adăugați înălbitor de culoare până când nu se mai vede purpuriu în apa utilizată pentru clătire. Acest lucru durează de obicei mai puțin de 10 secunde, sau chiar mai puțin timp dacă înălbitorul conține o concentrație mare de acetonă. Opriți imediat acest pas, în caz contrar vopseaua va scăpa și cristalul violet din celulele gram-pozitive și negative, iar procesul de colorare trebuie repetat. Clătiți imediat orice exces de înălbitor de culoare folosind tehnica anterioară.
- Acetona pură (95% +) poate fi utilizată ca înlocuitor. Cu cât utilizați mai multă acetonă, cu atât va funcționa mai repede decolorantul, deci trebuie să acordați mai multă atenție momentului.
- Dacă aveți probleme cu urmărirea timpului pentru acest pas, adăugați înălbitor de culoare picătură cu picătură.
Pasul 5. Presărați contra-vopseaua peste frotiu, apoi clătiți
O pată contra, de obicei safranină sau fucsină, este utilizată pentru a crește contrastul dintre bacteriile gram-negative și gram-pozitive, prin colorarea bacteriilor decolorate (decolorate), adică a bacteriilor gram-negative, roz sau roșu. Se lasă cel puțin 45 de secunde, apoi clătește.
Fuchsin va pata intens multe bacterii gram-negative, cum ar fi Haemophilus spp și Legionella spp. Această metodă este bună pentru începători
Pasul 6. Uscați lamela
Le puteți usca în aer liber pentru a le usca sau le puteți usca folosind hârtie bibuloasă vândută în acest scop. Procesul de colorare Gram este complet.
Metoda 3 din 3: Verificarea rezultatelor colorării
Pasul 1. Pregătiți microscopul cu lumină
Așezați diapozitivul la microscop. Bacteriile variază foarte mult în dimensiune, astfel încât mărirea totală necesară va varia de la 400x la 1000x. Pentru o imagine mai clară se recomandă un obiectiv obiectiv cu ulei de imersie. Aruncați uleiul de imersie pe lamelă, evitând mișcarea în timp ce picurați pentru a preveni formarea bulelor Mutați mânerul lentilei microscopului astfel încât obiectivul obiectiv să se fixeze în poziție și să atingă uleiul.
Imersiunea în ulei poate fi utilizată numai pe lentile special concepute, nu pe lentile „uscate”
Pasul 2. Încercați să identificați bacteriile gram pozitive și gram negative
Examinați lamela la microscopul cu lumină. Bacteriile gram-pozitive apar de culoare violet, deoarece cristalul violet este prins în peretele celular gros. Bacteriile gram-negative vor avea culoarea roz sau roșu, deoarece violeta cristalului este clătită prin pereții celulari subțiri, unde intră contra-colorantul roz.
- Dacă proba este prea groasă, rezultatul poate fi un fals pozitiv. Colorați un nou eșantion dacă prezintă toate bacteriile gram pozitive, pentru a vă asigura că rezultatul este corect.
- Dacă utilizați prea mult înălbitor de culoare, rezultatul poate fi un fals negativ. Colorați un nou eșantion dacă prezintă toate bacteriile gram negative, pentru a vă asigura că rezultatul este corect.
Pasul 3. Comparați rezultatele pe care le vedeți cu imaginea de referință
Dacă nu știți cum arată bacteriile, studiați colecția de imagini de referință, de obicei sortate după formă și pata Gram. De asemenea, puteți vizualiza baze de date online la [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos și multe alte site-uri online. Pentru a facilita identificarea, mai jos sunt exemple de bacterii întâlnite în mod obișnuit sau importante pentru diagnostic, clasificate în funcție de starea și forma lor Gram.
Pasul 4. Identificați bacteriile gram-pozitive pe baza formei lor
Bacteriile sunt clasificate în continuare în funcție de forma lor la microscop, cel mai frecvent sub formă de coci (sferici) sau tije (cilindrice). Iată câteva exemple de bacterii gram-pozitive (de culoare violet) în funcție de forma lor:
- Cocci gram pozitivi de obicei stafilococi (adică grup coci) sau streptococi (adică coci lanț).
- 'Tije Gram pozitive, cum ar fi Bacillus, Clostridium, Corynebacterium și Listeria. Bacteria tijei Actinomyces spp. au de obicei ramuri sau filamente.
Pasul 5. Identificați bacteriile gram negative
Bacteriile gram-negative (de culoare roz) sunt adesea clasificate în trei grupe. Cocii sunt de formă sferică, tijele sunt lungi și subțiri, în timp ce tijele de coccoid sunt între ele.
- Cocci gram negativi Cel mai frecvent este Neisseria spp.
- Tije gram-negative de exemplu, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas și mulți alții. Vibrio cholerae poate fi văzut ca o tulpină obișnuită sau o tulpină îndoită.
- „Coccoid” gram-negativ (sau „coccobacili”) bacterii cu tije de ex. Bordetella, Brucella, Haemophilus și Pasteurella
Pasul 6. Verificați cu atenție dacă rezultatele sunt amestecate
Unele bacterii sunt greu de colorat cu precizie, datorită fragilității sau naturii ceroase a pereților celulari. Aceste bacterii pot prezenta un amestec de violet sau roz în aceeași celulă sau între celule diferite în același frotiu. Probele bacteriene mai vechi de 24 de ore pot prezenta această problemă, dar există și unele specii bacteriene care rămân dificil de colorat la orice vârstă de prelevare. Aceste bacterii necesită teste mai specializate pentru identificare, cum ar fi colorarea rapidă a acidului, observarea în cultură bacteriană, mediul de cultură STI sau testarea genetică.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium și Propionibacterium spp. toate sunt bacterii gram-pozitive, dar adesea nu sunt clar colorate.
- Bacterii mici, subțiri, cum ar fi Treponema, Chlamydia și Rickettsia spp. greu de pătat prin metoda Gram.
Pasul 7. Eliminați consumabilele și echipamentele rămase
Această procedură de eliminare a deșeurilor variază între laboratoare și depinde de materialele utilizate. De obicei, lichidul din tava de colorare este eliminat în sticle etichetate ca deșeuri periculoase. Înmuiați lamele într-o soluție de înălbitor 10%, apoi aruncați-le într-un recipient pentru obiecte ascuțite.
sfaturi
- Amintiți-vă că rezultatele colorării Gram vor fi bune numai dacă proba este bună. Este important să informați pacienții, astfel încât aceștia să poată furniza un specimen bun (de exemplu, diferența dintre scuipat și tuse profundă pentru a obține o probă de spută).
- Ca decolorant, etanolul reacționează mai lent decât acetonă.
- Respectați reglementările standard de laborator pentru a asigura siguranța.
- Folosiți un tampon pe obraji pentru a practica, deoarece conține atât bacterii gram-pozitive, cât și bacterii gram-negative. Dacă vedeți un singur tip de bacterii, este posibil să utilizați prea puțină sau prea multă înălbitor.
- Puteți utiliza cleme de lemn pentru a fixa diapozitivul.
Avertizare
- Acetona și etanolul sunt substanțe inflamabile. Acetona va îndepărta uleiul din mâini, facilitând absorbția pielii de către alte substanțe chimice. Purtați mănuși și folosiți-le cu grijă.
- Nu lăsați frotiul să se usuce înainte de a clăti pata Gram sau contracolorarea.
De ce ai nevoie
- Eșantion de rețea
- Lamelă de sticlă
- Pipetă
- Sursă mică de incendiu sau încălzitor cu diapozitive sau metanol
- Apă
- Violet de cristal
- Iod
- Colorează înălbitor, cum ar fi alcoolul sau acetona
- Safranin
