Spectrofotometria este o tehnică experimentală utilizată pentru a măsura concentrația unui dizolvat într-o anumită soluție prin calcularea cantității de lumină absorbită de acea substanță. Această tehnică este foarte utilă, deoarece anumiți compuși vor absorbi diferite lungimi de undă ale luminii la intensități diferite. Analizând lumina care trece printr-o soluție, puteți identifica compușii dizolvați în soluție și concentrațiile acestora. Instrumentul folosit pentru a analiza soluțiile cu această tehnică în laborator este un spectrofotometru.
Etapa
Partea 1 din 3: Pregătirea probei
Pasul 1. Porniți spectrofotometrul
Majoritatea spectrofotometrelor trebuie încălzite înainte de a putea face măsurători precise. Deci, porniți mașina și apoi lăsați-o să stea cel puțin 15 minute înainte de a măsura proba.
Folosiți acest timp pentru a pregăti proba
Pasul 2. Curățați cuva sau eprubeta
În laboratoarele școlare, pot fi disponibile eprubete de unică folosință care nu trebuie curățate mai întâi. Cu toate acestea, dacă utilizați o cuvă obișnuită sau o eprubetă, asigurați-vă că ați curățat bine aparatul înainte de utilizare. Clătiți toate cuvetele cu apă deionizată.
- Aveți grijă să folosiți cuvete, deoarece acestea sunt destul de scumpe.
- În timp ce utilizați cuva, nu atingeți partea pe care trece lumina (de obicei partea limpede a recipientului).
Pasul 3. Se toarnă suficientă probă în cuvă
Volumul maxim al unei părți din cuvetă este de 1 ml, în timp ce volumul maxim al eprubetei este de 5 ml. Măsurătorile dvs. trebuie să fie exacte, atâta timp cât lumina spectrofotometrului poate trece în continuare prin eșantion și nu o parte goală a containerului.
Dacă utilizați o pipetă pentru a insera probe, utilizați un sfat nou pentru fiecare probă. În acest fel, se poate evita contaminarea încrucișată
Pasul 4. Pregătiți soluția de control
Aceste soluții, care sunt, de asemenea, cunoscute sub numele de semifabricate sau semifabricate conțin doar solventul din soluția analizată. De exemplu, dacă aveți o probă de sare dizolvată în apă, soluția goală de care aveți nevoie este apă. Dacă apa pe care o utilizați este roșie, ar trebui să utilizați și o soluție goală roșie. Utilizați un recipient similar pentru a menține soluția goală în același volum ca proba.
Pasul 5. Ștergeți exteriorul cuvei
Înainte de a introduce cuva în spectrofotometru, trebuie să vă asigurați că este curată pentru a evita interferențele cu măsurătorile datorate particulelor de praf sau impurităților. Utilizați o cârpă fără scame pentru a îndepărta orice picături de apă sau praf care aderă la exteriorul cuvei.
Partea 2 din 3: Experimentarea
Pasul 1. Determinați și reglați lungimea de undă a luminii pentru a analiza proba
Utilizați o singură lungime de undă a luminii (fascicul monocromatic) pentru a crește eficacitatea măsurării. Alegeți culoarea luminii care poate fi absorbită de conținutul chimic despre care se crede că este dizolvat în proba de testare. Setați lungimea de undă în conformitate cu specificațiile spectrofotometrului pe care îl utilizați.
- În laboratoarele școlare, aceste lungimi de undă vor fi de obicei indicate în instrucțiunile experimentale.
- Deoarece proba va reflecta toată lumina vizibilă, lungimea de undă a culorii luminii experimentale este de obicei diferită de culoarea probei.
- Un obiect apare o anumită culoare, deoarece reflectă o anumită lungime de undă și absoarbe toate celelalte culori. Iarba apare verde deoarece clorofila din ea reflectă verde și absoarbe alte culori.
Pasul 2. Calibrați spectrofotometrul cu o soluție goală
Așezați soluția goală în suportul cuvei și închideți spectrofotometrul. Pe ecranul spectrofotometrului analogic, există un ac care se va mișca pe baza intensității detectării luminii. După ce soluția goală este introdusă, acul trebuie să se deplaseze spre dreapta. Înregistrați această valoare în cazul în care aveți nevoie de ea mai târziu. Lăsați soluția goală să rămână în spectrofotometru, apoi glisați acul la zero folosind butonul de reglare.
- Spectrofotometrele digitale pot fi, de asemenea, calibrate în același mod. Cu toate acestea, acest instrument este echipat cu un ecran digital. Setați citirea soluției goale la 0 cu butonul de control.
- Chiar dacă soluția goală este îndepărtată din spectrofotometru, calibrarea va fi în continuare valabilă. Deci, atunci când măsurați întreaga probă, absorbanța martorului va fi redusă automat.
Pasul 3. Scoateți martorul și testați rezultatele calibrării spectrofotometrului
Chiar și după ce soluția goală este scoasă din spectrofotometru, acul sau numărul de pe ecran ar trebui să citească în continuare 0. Puneți soluția goală înapoi în spectrofotometru și asigurați-vă că citirea nu se schimbă. Dacă spectrofotometrul este calibrat corespunzător folosind o soluție goală, rezultatul de pe ecran ar trebui să fie încă 0.
- Dacă acul sau numărul de pe ecran nu citesc 0, repetați pașii de calibrare cu o soluție goală.
- Dacă problema persistă, căutați ajutor sau cereți cuiva să verifice spectrofotometrul.
Pasul 4. Măsurați absorbanța probei
Scoateți soluția goală și introduceți proba în spectrofotometru. Așteptați aproximativ 10 secunde pentru ca mâinile să se stabilizeze sau numerele de pe afișajul digital să nu se mai schimbe. Se înregistrează procentajul transmitanței și / sau absorbanței probei.
- Cu cât este transmisă mai multă lumină, cu atât mai puțină lumină este absorbită. De obicei, trebuie să înregistrați valoarea absorbanței eșantionului, care este în general exprimată ca număr zecimal, de exemplu 0,43.
- Repetați măsurarea fiecărei probe de cel puțin trei ori și apoi calculați media. În acest fel, rezultatele obținute vor fi mai exacte.
Pasul 5. Repetați experimentul cu diferite lungimi de undă ale luminii
Eșantionul dvs. poate conține mai mulți compuși care au absorbanțe diferite în funcție de lungimea de undă a luminii. Pentru a reduce incertitudinea, repetați măsurătorile eșantionului la intervale de lungime de undă de 25 nm în spectrul luminii. În acest fel, puteți detecta alte substanțe chimice dizolvate în probă.
Partea 3 din 3: Analiza datelor de absorbție
Pasul 1. Calculați transmitanța și absorbanța probei
Transmitanța este cantitatea de lumină care poate trece prin eșantion și ajunge la spectrofotometru. Între timp, absorbanța este cantitatea de lumină absorbită de unul dintre substanțele chimice dizolvate din probă. Există multe spectrofotometre moderne care dau ieșire sub formă de transmitanță și absorbanță. Cu toate acestea, dacă obțineți o valoare a intensității luminii, puteți calcula și voi aceste două valori.
- Transmitanța (T) poate fi determinată prin împărțirea intensității luminii care trece prin soluția probă la cantitatea de lumină care trece prin soluția goală. Această valoare este de obicei exprimată ca număr zecimal sau procent. T = I / I0, unde I este intensitatea eșantionului și I0 este intensitatea necompletată.
- Absorbanta (A) este exprimata ca o transmitenta de logaritm (exponent) de baza 10 negativa: A = -log10T. Deci, dacă T = 0, 1, A = 1 (0, 1 este 10 la puterea -1). Aceasta înseamnă că 10% din lumină este trecută, în timp ce 90% este absorbită. Între timp, dacă T = 0,01, A = 2 (0,01 este 10 la puterea -2). Aceasta înseamnă că lumina care este transmisă este de 0,1%.
Pasul 2. Graficează valoarea absorbanței față de lungimea de undă
Exprimați valoarea absorbanței ca axa y și lungimea de undă ca axa x. Din punctele tuturor rezultatelor absorbantei în fiecare lungime de undă, veți obține spectrul de absorbanță al probei și veți identifica conținutul compusului și raportul său în probă.
Spectrele de absorbție au de obicei vârfuri la anumite lungimi de undă. Aceste lungimi de undă de vârf vă permit să identificați compuși specifici
Pasul 3. Comparați spectrul de absorbanță cu un grafic al unui compus cunoscut
Fiecare compus are un spectru de absorbanță unic și are întotdeauna aceeași lungime de undă de vârf în fiecare măsurare. Comparând graficul obținut cu un grafic al unui anumit compus cunoscut, puteți identifica conținutul de substanță dizolvată din soluția eșantion.
